古DNA (ancient DNA) 是指从考古和古生物化石标本中获取的古代生物DNA分子(Herrmann and Hummel, 1994).目前人们可以在古DNA等古代生物分子的尺度上研究生物的系统分类学、人类的起源和迁移、亲缘关系, 动植物的家养和驯化过程、考古材料的动植物残骸的精确鉴定等与古生物学、古人类学和考古学许多重要问题密切相关的课题(Poinar, 1999; 赖旭龙, 2001).

生物死亡后由于水解和氧化作用, 古DNA总是以高度片段化、低分子量的形式存在于古代材料中, 从而增加了古DNA提取的难度.目前一般认为可靠的古DNA数据应晚于10万年(Poinar, 1999; Poinar et al., 1996; Lindahl, 1997).这样10万年以来的亚化石, 尤其是考古材料, 是目前古DNA研究的重点, 其中大量的古DNA研究集中在古人类材料上, 并取得了以欧洲尼安德特人古DNA研究为代表的一些重要的研究成果(Krings et al., 1997; Ovchinnikov et al., 2000).我国的古DNA研究除杨淑娟和赖旭龙(2003)报道了华北地区晚更新世猛犸象的古DNA研究和林清等(2002)报道了从青藏高原多年冻土中获得了古代眼子菜的古DNA序列的初步成果外, 其他研究也主要集中在古人类DNA方面, 如Yang et al. (1999)提取了公元前475—221年战国时期河北徐水的人类残骸中的线粒体DNA的D环区片段; Wang et al. (2000)从山东临淄地区2 000~2 500年前的古人骨中获得了3个不同历史年代人类群体的DNA, 在此基础上讨论了不同历史时期山东半岛人群的分布及遗传结构与现代人的异同性; 万诚等(2001)在内蒙古夏家店(2 000~3 000年前) 和河南郑州西山(5 000年前) 4个古代人骨中获得了长度为205 bp的线粒体DNA中MTND4基因和121 bp的线粒体DNA中V区基因, 揭示了河南郑州西山古人类与内蒙古古人类之间具有高度的分异性; 崔银秋等(2002)从距今2 000~2 500年左右的新疆交河古城车师人的古代人骨中获得了3个吐鲁番盆地土著民族的363 bp的线粒体调控区基因.

本文主要报道笔者首次从陕西西安半坡博物馆馆藏的新石器时代仰韶文化姜寨遗址古人类遗骸中成功获得的距今约6 000多年前的线粒体高变控制区ⅠDNA 169 bp的片段, 并论证了其可靠性和可重复性.

1.   实验材料

本研究样品采自新石器时代仰韶文化姜寨遗址.姜寨遗址位于陕西省临潼县骊山北麓临河与渭河交汇处的三角地带(西安半坡博物馆等, 1988).1972—1979年, 西安半坡博物馆联同陕西省考古研究所及临潼县博物馆在姜寨遗址进行了大规模的考古发掘, 揭露一处史前聚落与墓地.大部分出土文物为半坡博物馆保存.本次古DNA研究的样品来自半坡博物馆库房, 分别从6个个体中提取了6个样品.姜寨遗址的史前文化堆积共分5层, 3个样品是从遗址的一期文化层墓葬取得, 另外3个样品是从姜寨的二期文化层取得.考古学家认为姜寨一期属仰韶文化半坡型, 根据姜寨遗址的3个¹⁴C测定数据, 并经高精度树轮年代校正, 年代应在距今6 300~6 900年之间; 姜寨二期遗存属仰韶文化史家类型, 根据遗址所出的一个¹⁴C测定数据, 校正年代约为距今5 500~5 800年(西安半坡博物馆等, 1988; 中国社会科学院考古所, 1991).

姜寨遗址墓葬人骨的编号及采集情况见表 1.样本收集采用一次性手术刀片将取样部位轻轻刮去5 mm的外表层, 然后用5 mm直径的钻头钻取内部, 所得粉末立即装入已消毒、灭菌的试管中, 密封, 低温保存.

表  1  样本采集及实验结果

Table  Supplementary Table   Sampling description and experimental results

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2.   方法

2.1   古DNA提取

备样在无菌工作环境中进行, 戴一次性手套, 将样品置入研钵, 加液氮研磨至粉末状.提取方案参照1990年Thomas设计的提取方案(Thomas et al., 1990), 其简单步骤如下: (1) 在装有0.2 g左右的1.5 mL的微量离心管中加入1 mL 0.5 mol/L ED-TA缓冲液, 于37 ℃恒温振荡以去钙质; (2) 离心去上清, 加入1 mL提取缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 10 mmol/L NaCl, 0.5 mg/mL proteinase K, 10 mg/mL DTT, 1% SDS), 于50 ℃左右恒温振荡12 h; (3) 离心将上清转移到另外的离心管中, 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1) 抽提; (4) 12000×g离心5 min, 将上层液相转移至无菌的离心管中, 加入1/10体积、3 mol/L NaAc, 混匀, 再加入两体积的冰冷无水乙醇, 冰上放置5~6 h; (5) 于4 ℃, 12000×g离心5 min; (6) 用75%乙醇洗涤沉淀, 室温干燥后, 用1×TE缓冲液溶解, -20 ℃保存.

2.2   PCR扩增

本实验所用试剂为Takara和Promega公司产品.所扩增的目标DNA为线粒体控制区ⅠDNA片段, 引物的选用参考Krings等对尼安德特人的研究(Krings et al., 1997), 由宝生物公司(Takara) 合成.所用引物如下:

L16122:5 & apos; -CAT TAC TGC CAG CCA CCA TGA ATA-3 & apos;

H16271:5 & apos; -GTG GGT AGG TTT GTT GGT ATC CTA-3 & apos;

50 μL的PCR反应液体系中含有以下组分: 1×PCR缓冲液, 2 mmol/L MgCl₂, 250 μmol/L dNTPs, 0.5 mmol/L BSA, 0.5 mmol/L引物, 2 μL模板, 2.5 U Taq DNA聚合酶.PCR反应条件为94 ℃预变性4 min, 每一个循环包括94 ℃变性25 s, 60 ℃复性1 min, 72 ℃延伸1 min, 循环35个循环, 最后一个循环后置72 ℃继续延伸5 min.

用0.5×TAE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖凝胶, 于0.5×TAE电泳缓冲液中, 5 V/cm电泳检测扩增产物, 用100 bp DNA ladder作标准对照(图 1).

图  1  姜寨人线粒体D-环区高变控制区Ⅰ PCR扩增凝胶图像

M.100 bp DNA标记物; 1.阴性控制样; 2.13#样品DNA; 3.26#样品DNA

Fig.  1.  Gel electrophoresis image of PCR products of two hypervariable region Ⅰ segments in mitochondrial D-loop region from the human remains at Jiangzhai Site

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2.3   测序

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离, 溴化乙锭染色, 在长波长紫外灯下观察凝胶, 用无菌手术刀切下所需胶带, 然后用E.Z.N.A^Ⓡ Gel Extraction Kit 2000 (Promega) 试剂盒纯化.以纯化PCR产物为模板进行测序反应, 测序引物为PCR扩增引物, 所用试剂为PCR sequencing version 3.0 Kit (ABI).将测序反应产物用70%乙醇纯化, 室温干燥, 在自动测序仪ABI PRFSM^TM-3700上测序.所测试的不同个体样品均获得长度为169 bp的序列.

3.   序列分析

3.1   对位排列

测序结果通过BLAST查询, 与现代人类具有很高的相似性, 但未见相同序列.通过BioEdit序列分析软件将姜寨人线粒体高变区Ⅰ的DNA片段和其相关序列进行排列, 所获得的序列与现代西安人有2个点位的突变, 无碱基插入现象(图 2).

图  2  姜寨人线粒体D-环区高变区Ⅰ DNA片段的对位排列分析

点号代表与姜寨人相同的位点; 短线代表缺失位点, 位点数字是根据人类线粒体系统编排; Yangshao.姜寨人(本研究); Taiwan.台湾兰屿岛雅美族土著人种(基因库编号: AJ512135.1);Mongolia.现代蒙古人(HSU33399) (Kolman et al., 1996); Xianwang.现代西安人(AB048131.1) (Oota et al., 2002); Somalia.现代非洲索马里人(U94161) (Watson et al., 1996); Slovakia.现代东欧斯洛伐克人(AJ240288);Israel.现代以色列人(AF258446) (Macaulay et al., 1999); Indian.现代印度人(AJ234979);Neandertal.尼安德特人(AF011222) (Krings et al., 1997); Chimpanzee.非洲黑猩猩(AF176755) (Goldberg and Ruvolo, 1997)

Fig.  2.  Sequence alignment of hypervariable region Ⅰ DNA sequences in mitochondrial D-loop region of Jiangzhai people

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3.2   系统发育分析

以现代非洲黑猩猩作为外类群, 用简约法构建系统树, 如图 3所示.

图  3  用简约法构建的姜寨人线粒体D-环区高变区Ⅰ的系统树(数字代表自展支持率, 其余代号同图 2)

Fig.  3.  Phylogenetic tree based on hypervariable region Ⅰ DNA sequences in mitochondrial D-loop region of Jiangzhai people using maximum parsimony with exhaustive search

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4.   实验结果可靠性分析

由于古DNA总是以微量的形式存在于古代样品之中, 古DNA研究离不开PCR扩增.鉴于PCR反应的高度灵敏性, 稍有不慎就可能扩增标本中的外源DNA, 从而得出错误的结论.对于古人类研究而言还多了一个可能的污染源, 即实验操作者——现代人的污染.所以, 在样品采集和实验操作过程中要时刻注意严格防止可能的污染, 而对于古DNA序列尤其是古人类序列的可靠性研究和讨论是十分重要的(杨洪, 1995).其中最为重要的检验标准之一是所设计的古DNA实验是否能重复并能获得相同的结果(HÖss et al., 1996; Yang et al., 1997; Poinar, 2003). Wayne et al. (1999)通过综合分析古DNA最初研究的10多年里的成果, 认为许多被报道的年代较老的序列不能够获得重复性实验的支持, 因此这些成果的可靠性要打上问号.本研究从以下几点可以证明姜寨人古DNA的可靠性:

(1) 样品采集地点比较干燥、古地温不算太高, 这种环境对于古DNA的保存有利(Herrmann and Hummel, 1994; Poinar et al., 1996).另外, 样本保存年限不到7 000年, 不存在超过古DNA保存的10万年的理论年限的问题. (2) 在样品采集、备样和实验操作过程中自始至终按古DNA研究的规范执行(Poinar, 2003).样品准备和DNA提取安排在不同实验室进行, 所用器具、器皿及有关试剂都经过高温高压灭菌, 且使用一次性耗材, 避免了实验室内的污染. (3) PCR扩增的阴性控制样没有出现DNA条带. (4) 用BLAST软件从分子数据库中查询的结果分析, 样本的序列不仅是人类线粒体控制区的序列, 且具有很高的相似性, 同时与现代西安人的同源序列有2个位点发生了突变, 说明所得到的序列是古人DNA序列.而且在所构建的系统发育树上, 所获得的姜寨人古DNA序列出现在合理的位置上, 即姜寨人序列出现在由尼安德特人为外类群的现代人之中.其中的低抽样自检值反映了由短序列所造成的不确定性(杨洪, 1995). (5) 最为重要和最有说服力的是该研究获得了成功的重复性实验的支持.本研究的重复性实验包括: 同样样品在同一实验室由唐先华、杨淑娟、盛桂莲等先后操作多次得到相同的结果; 相同样品(26#, 13#样品) 与相同的实验方案在中山大学生命科学院的重复性实验已获得相同的结果.

5.   结论

(1) 通过对6 000多年前的姜寨遗址古人类残骸的古DNA提取初步结果和实验结果的可重复性实验等方面的论证, 说明从仰韶文化遗址的古人类中获取古代人类的遗传信息是可能的. (2) 本研究所提取的6个姜寨人样品中有3个样品获得了古DNA, 古DNA的提取成功率为50%, 高于一般的古DNA研究材料的提取率, 说明姜寨人是古DNA研究较为理想的材料.高强和李润权曾经利用仰韶遗骨的颅骨面相测量讨论墓葬死者的血缘关系(Gao and Lee, 1993), 相信今后通过对姜寨人残骸中古DNA的提取能够把这类研究提升到分子水平.另外, 通过分析古人类X、Y染色体的特定的DNA序列的研究, 可以用分子生物学的方法对古人类的性别进行分子鉴定, 从而与体质人类学的性别鉴定方法相互印证对比. (3) 古人类DNA研究的一个重要的方向就是进行人类的分子演化研究.尽管从本文中的有限系统发育树暗示现代西安人和现代蒙古人之间的相似性高于现代西安人和姜寨人之间的相似性等初步结论, 但笔者认为这方面的工作还有待进一步深入.今后将通过不同引物的设计, 获取姜寨人和仰韶文化其他遗址的古人类的更长的古DNA片段, 并加强其与已报道的中国古代人和现代人DNA的对比分析, 从而可在分子水平上进一步讨论人类学问题.